分(fēn)子筛结果解读
尺寸排阻色谱(SEC)也称為(wèi)凝胶色谱,俗称分(fēn)子筛。当洗脱液為(wèi)水溶液或缓冲液时,称為(wèi)凝胶过滤色谱(GFC),在生物(wù)學(xué)领域应用(yòng)广泛;当使用(yòng)有(yǒu)机溶剂作為(wèi)洗脱液时,称為(wèi)凝胶渗透色谱(GPC),被广泛用(yòng)于高分(fēn)子领域。尺寸排阻色谱通常用(yòng)于分(fēn)离高分(fēn)子化合物(wù),如组织提取物(wù)、多(duō)肽、蛋白质和核酸。
尺寸排阻色谱基于蛋白质分(fēn)子量或分(fēn)子形状的差异对样品进行分(fēn)离。当样品从色谱柱顶部向下移动时,大的蛋白质分(fēn)子无法进入凝胶颗粒并被快速洗脱;而较小(xiǎo)的蛋白质分(fēn)子可(kě)以进入凝胶颗粒,并且较小(xiǎo)的蛋白质进入凝胶的保留时间不同。分(fēn)子量越大,洗脱时间越早,从而使具有(yǒu)不同分(fēn)子大小(xiǎo)的蛋白质被分(fēn)离。
图1.體(tǐ)积排阻色谱法原理(lǐ)(Wolf et al, 2015)
在蛋白分(fēn)离纯化中也常用(yòng)到分(fēn)子筛,主要有(yǒu)两个作用(yòng),一是分(fēn)离纯化;二是蛋白分(fēn)析,新(xīn)手接触的时候不知道怎么去分(fēn)析分(fēn)子筛结果,下面以不同的实例解读一下些各自的區(qū)别。
分(fēn)离纯化作用(yòng)
在科(kē)研实验中,蛋白纯化第一步通常采用(yòng)亲和层析,但一步层析大部分(fēn)情况下很(hěn)难达到很(hěn)高的纯度,根据SDS-PAGE胶图结果,可(kě)以选用(yòng)分(fēn)子筛来进一步分(fēn)离纯化目的蛋白,需要注意的是分(fēn)子筛规格的选择,不同大小(xiǎo)的蛋白选用(yòng)的柱子规格可(kě)能(néng)有(yǒu)差异,需要结合分(fēn)子筛柱的分(fēn)辨率来选择,不熟悉的话可(kě)以查询柱子说明书。
图2.镍柱纯化结果
(泳道8、9為(wèi)Elution结果)
图3.泳道8/9过分(fēn)子筛图谱
图4. 分(fēn)子筛電(diàn)泳结果
从结果可(kě)看出分(fēn)子筛能(néng)有(yǒu)效分(fēn)离杂蛋白与目的蛋白。但要注意的是,使用(yòng)分(fēn)子筛分(fēn)离纯化目的蛋白的时候分(fēn)子量之间应该有(yǒu)较大差异(一倍以上分(fēn)子量)才能(néng)有(yǒu)效分(fēn)离。
蛋白分(fēn)析作用(yòng)
分(fēn)子筛的另一个作用(yòng)是作為(wèi)蛋白分(fēn)析工具,多(duō)聚集态蛋白与单體(tǐ)蛋白分(fēn)子量不一样,复合物(wù)与单个亚基分(fēn)子量也不一样,分(fēn)子筛可(kě)以利用(yòng)这种有(yǒu)差异的分(fēn)子量来分(fēn)析、分(fēn)离蛋白状态。
图5.蛋白分(fēn)析结果
(泳道1為(wèi)亲和层析样品,纯度高,分(fēn)子筛有(yǒu)两个峰,主峰明显,
可(kě)能(néng)是二聚體(tǐ)或者是多(duō)聚體(tǐ),样品均一性较好)
图6.蛋白分(fēn)析结果
亲和层析纯化后蛋白样品纯度高,分(fēn)子筛分(fēn)析出现两个明显峰尖,sds-pag胶检测蛋白大小(xiǎo)一致,可(kě)以看出蛋白纯化后均一性不高,多(duō)聚态和单體(tǐ)混合存在,通过分(fēn)子可(kě)以分(fēn)离出不同状态蛋白,后续可(kě)根据需要选用(yòng)不用(yòng)状态蛋白开展工作。