原核表达包涵體(tǐ)复性实例
前言
包涵體(tǐ)在原核表达中非常常见,但是没有(yǒu)一个通用(yòng)的复性解决方案,常用(yòng)的复性手段有(yǒu)稀释复性、透析复性、分(fēn)子筛及离子柱层析等,复性遵循原则:低温、低浓度、小(xiǎo)梯度,下面我们分(fēn)享三个蛋白复性的实例。
先复性后纯化
细菌破碎后离心收集沉淀,trisbuffer洗涤包涵體(tǐ)3-5次,跑胶检测包涵體(tǐ)纯度
用(yòng)5-10ml 6M盐酸胍(ph1.5)溶解包涵體(tǐ),室温搅拌30min-1h,离心去除不溶物(wù);
将溶解后包涵體(tǐ)蛋白快速滴定到4℃预冷pbs中,缓慢搅拌,过夜复性,离心去除沉淀;
缓慢加(40%)硫酸铵,3h后离心去沉淀(未完全复性的蛋白);加终浓度70%硫酸铵,4℃过夜孵育,离心取沉淀,溶解到5-10ml pbs中即為(wèi)目的蛋白。
复性结果如下图所示
图1.包涵體(tǐ)检测
泳道1:盐酸胍溶解包涵體(tǐ) 泳道2:包涵體(tǐ)洗涤后
图2.蛋白复性后检测
1.破胞后洗涤沉淀,沉淀用(yòng)变性剂buffer(8M脲)室温溶解3h后高速离心去除沉淀,上清中加入Ni填料,4℃混匀孵育2h;
2.孵育结束后转移beads至层析柱,依次用(yòng)不同浓度咪唑Wash buffer冲洗柱子;
3.Elute buffer洗脱蛋白后跑胶检测纯度;
4.包涵體(tǐ)复性:变性蛋白测浓度后滴定入复性buffer( 100 mM Tris–HCl, 0.5M 甘氨酸, 1 mM氧化型谷胱甘肽,10 mM 还原型谷胱甘肽, pH8.0) ,使蛋白终浓度為(wèi)0.1mg/ml, 缓慢搅拌,4℃复性反应过夜,离心去除沉淀,上清转移到透析袋,pbs透析4h,换液至少2次,浓缩后过分(fēn)子筛。
复性结果如下图所示
图3.包涵體(tǐ)纯化结果
泳道1為(wèi)包涵體(tǐ)溶解后上清,泳道2為(wèi)包涵體(tǐ)溶解后沉淀,泳道3為(wèi)20mM洗杂,泳道4為(wèi)40mM洗杂,
泳道5為(wèi)60mM洗杂,泳道6為(wèi)100mM洗杂,泳道7為(wèi)300mM洗脱,泳道8、9為(wèi)500mM洗脱
图4.复性后检测结果
柱上复性
层析柱上复性与普通亲和层析操作类似,只是在细胞破碎时候用(yòng)变性buffer(如8M脲),离心后上清蛋白溶液正常上层析柱,洗杂过程中依次降低变性剂含量,如8M-6M-4M-2M-1M-0.5M-0,使蛋白在层析柱上复性,最后用(yòng)不含变性剂的咪唑buffer洗脱,即可(kě)得到复性后蛋白,实例图如下:
图5.亲和层析结果
泳道1為(wèi)诱导前,泳道2為(wèi)诱导后,泳道3為(wèi)破碎后沉淀(变性剂破碎),泳道4為(wèi)破碎后上清(变性剂破碎),
泳道5為(wèi),泳道6為(wèi)6M尿素洗杂,泳道7為(wèi)4M尿素洗杂,泳道8為(wèi)2M尿素洗杂,泳道9為(wèi)1 M尿素洗杂,
泳道10為(wèi)0.5M尿素洗杂,泳道11為(wèi)0M尿素复性洗杂,泳道12為(wèi)300mM咪唑洗脱,泳道13、14為(wèi)500mM咪唑洗脱。
复性洗脱后根据实验需求再进一步纯化即可(kě)。
小(xiǎo)结
包涵體(tǐ)形成原因较多(duō),方法也就不一而论,需要各种尝试才能(néng)找到一个合适的方法,需要一点运气,更需要的是对科(kē)研的探索精神。